医思倍-生物细胞培养实行：细胞清醒—细胞传代—细胞冻存
【实操视频】生物细胞培养实行标准利用：细胞清醒—细胞传代—细胞冻存
目标：
标准生物细胞扩增培养利用历程，以确保后果的准确、可靠。
使用范围：
生物细胞培养。
实行原理：
从活的机体中取出构造或细胞，疏散成多个单细胞，模仿机体内的发展情况，在体外创建无菌、适平和一定养分条件等，使其在体外情况中持续生长繁衍的历程，并且可以坚持其在机体内的布局和功效的武艺。
试剂准备：
(1) PBS：磷酸盐缓冲液，每L含有：
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.15g
KH2PO4 0.2g
PH=7.3-7.6
不克不及含有Ca2+和 Mg2+；
(2) 胰酶：胰卵白酶，含0.25%EDTA，PH=7.1-8，长时储存温度为-20°C，使用时发起分装于4°C保存，使用前37°C水浴；
(3) 胶原酶：必要现用现配，I 型胶原酶对应上皮构造、肺、脂肪、肾上腺构造，I V型胶原酶保举用于胰腺构造和胰岛的分散，II 型胶原酶可使用、肝、骨、甲状腺、心脏、唾液腺；
(4) 0.4%台盼蓝：使用4G台盼蓝粉末溶于100ml生理盐水或PBS，设置为4%的台盼蓝母液置于4°C保存，用于细胞计数时，浓缩十倍，取体积1:1与细胞悬液殽杂匀称；
(5) 冻存液：10%DMSO+90%胎牛血清，使用时可对计数后的细胞沉淀举行重悬到安稳浓度。
质量控制：
细胞的质量控制包含数目、活率、外表标志、支原体和内毒素等。
(1) 细胞数目：细胞传代前培养瓶交融率应到达80%；细胞冻存时每管细胞量应到达5*106个/ml以上。
(2) 细胞活率：颠末冻存的细胞制剂在清醒后细胞活率更不应该低于80%；举行实行时，铺板细胞的活率不应低于90%，且铺板细胞数以活细胞数目为准。
(3) 细胞外表标志物：原代细胞的传代质检依据细胞情况检测外表标志物的表达情况。
(4) 支原体、内毒素：传代、冻存历程中都要确保无支原体、无内毒素。
利用历程分析：
1.清醒
(1) 从液氮罐中取出冻存管；
(2) 敏捷放入37℃水浴，不时动摇，使其急速消融，30～60s内完成；
(3) 冻存管用75％酒精擦拭消毒后，掀开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再到场10ml培养液；
(4) 使用低速离心（500～1000r/min）5min，去上清后再用培养液洗一次，反复离心；
(5) 弃上清液，用培养液得当浓缩后，装入培养瓶举行培养，越日改换一次培养液后，持续培养。
2.传代利用
(1) 培养基、胰酶、PBS等事先30min使用37摄氏度水浴；
(2) 从培养箱拿出细胞，当细胞交融率到达85%以上可开头传代；
(3) 吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液，使用PBS洗净残留培养基，并倒干净；
(4) 向瓶内到场胰卵白酶液少数，以能掩盖培养瓶底为宜，T25瓶用量为1ml，T75瓶用量为1-2ml；
(5) 置37℃孵箱或室温（25℃）下举行消化，把培养瓶放在倒置显微镜，察看细胞形态，以细胞全部变圆且轻小扣打瓶身有局部掉落为准；
(6) 直接到场少数含血清的培养基停止消化；
(7) 使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按排序反复悄悄吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁寥落；
(8) 使用计数板计数后，推断细胞浓度；
(9) 使用离心机离心细胞，使用定量培养基举行重悬，使细胞浓度到达所必要求，分散接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中举行培养；
(10) 细胞培养换液时间应依据细胞生长的形态和实行要求来确定，寻常2～3d后应换。
3.冻存
(1) 选对数增生期细胞(证实无支原体沾染)，在冻存前1d换液；
(2) 按常规办法把培养细胞制备成悬液，计数；
(3) 到场配制好的冻存液（90%胎牛血清，10%DMSO），使细胞浓度为1*106个/ml；
(4) 用吸管悄悄吹打令细胞重悬，分装入2ml无菌冻存管（事先在冻存管上写清细胞称呼、代数、密度、利用人、利用时间）中；
(5) 将冻存管转移到步骤降温盒（事先4°C预冷半个钟）中，将步骤降温盒放入-80°C安排2H以上或留宿；
(6) 快速将冻存管转移到冻存纸盒，并放入液氮罐，完成细胞冻存表纪录。
特别后果报告办法及处理流程：
(1) 若细胞清醒后发觉特别，如支原体沾染、细胞存活率低阶，应当及时反应；
(2) 若细胞培养历程中产生特别，如培养液显现污浊、细胞多量殒命、显现空斑等征象，应当及时报告扫除缘故；
(3) 若细胞培养历程中，显现沾染等情况，应当及时报告，并且彻底干净、消毒实行室；
(4) 若细胞存活率低、生长速率慢，在扫除细胞本身特性后，应依据细胞代数等缘故及时排查，必要时清醒较前代细胞。
注意事项：
1.实行室准备
(1) 定期打扫无菌室：每周打扫一次，使用84消毒液拖地、擦桌子、超净事情台外壁；
(2) 培养箱灭菌：使用75%酒精擦拭内壁，再用紫外灯照射；
(3) 实行前灭菌：掀开紫外灯、三氧杀菌机、氛围过滤器体系各20-30分钟；
(4) 实行后灭菌：用75%酒精擦拭超净台、边台、倒置镜的载物台；
(5) 准确摆放使用的器具：确保充足的利用空间，不仅便于利用并且可变小沾染的概率；
(6) 扑灭酒精灯：使用95%的酒精，注意火焰不克不及太小，偏激时用焰心；
(7) 培养箱设置：CO2浓度为5%，湿度为95%，37℃。
2.物料准备
(1) 但凡带入超净事情台内的酒精、PBS、培养基、胰卵白酶的瓶子均要75％酒精擦拭瓶子的外外貌，接近酒精灯火焰利用；
(2) 器皿使用前必需偏激灭菌，持续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要偏激；
(3) 种种利用要接近酒精灯，举措要轻、准确，不乱碰；
(4) 吸取两种以上的使用液时要注意改换吸管，避免交织沾染。
3.渣滓处理
(1) 一次性废物处理：储存于黄色医疗废物渣滓袋，定期灭菌丢弃；
(2) 废弃培养基处理：会合培养基废液桶中，使用84消毒液举行细胞灭活/灭菌处理，定期交由环保公司处理；
(3) 平凡渣滓处理：平凡渣滓如包装盒、塑料纸等，可与生存渣滓一同处理；
(4) 尖利器物处理：使用较硬的瓶子等会合装好，标注尖利器物，定期丢弃。
4.实行室宁静标准
(1) 必需一直穿着得当的一局部防护装备，手套沾染时应当改换，将用过的手套与其他沾染的实行室废物一同处理；
(2) 利用约莫具有危害的物质后以及分开实行室前应洗手；
(3) 在实行室内不克不及进食、饮水、吸烟、处理隐形眼镜、涂抹扮装品或存放供人食用的食品；
(4) 恪守地点机构关于锐器（即：针头、手术刀、吸管和决裂的玻璃器皿）宁静利用的准则；
(5) 警惕利用，尽力制止构成气体挥发或泼溅；
(6) 实行开头前、完毕后以及约莫具有影响性的物质产生泼溅时，应立刻使用得当的去污剂对一切事情台面举行去污；
(7) 无论实行室装备对否被沾染，都应定期举行干净；
(8) 在对约莫具有影响性的物质举行处理前应先去除沾染；
(9) 产惹事故约莫招致影响性物质暴露时，影响干系职员（比如：实行室主管、宁静员）报告。
